恙蟲病預(yù)防控制技術(shù)指南
恙蟲病（scrub typhus或tsutsugamushi disease），又名叢林斑疹傷寒，是由恙蟲病東方體（Orientia tsutsugamsushi，Ot，原稱恙蟲病立克次體（Rickettsial tsutsugamushioi）所引起的自然疫源性疾病。以鼠類為主要傳染源，經(jīng)恙螨幼蟲叮咬傳播。臨床以發(fā)熱、焦痂或潰瘍、淋巴結(jié)腫大及皮疹為特征，嚴(yán)重者可發(fā)生死亡。本病主要流行于熱帶和亞熱帶，東亞各國(guó)流行較為廣泛。恙蟲病在我國(guó)呈廣泛分布，大部分省份都曾有病例報(bào)告。我國(guó)恙蟲病疫情在80年代末期達(dá)到高峰，年報(bào)告約2500例。1989年后不再列為法定報(bào)告?zhèn)魅静?。近年?lái)許多地區(qū)開始網(wǎng)絡(luò)直報(bào)，全國(guó)病例報(bào)告數(shù)呈上升趨勢(shì)，北方地區(qū)流行范圍不斷擴(kuò)大，多次出現(xiàn)局部暴發(fā)疫情。由于醫(yī)務(wù)人員對(duì)該病缺乏認(rèn)識(shí)，故易發(fā)生誤診和漏診，導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥甚至死亡。為指導(dǎo)臨床醫(yī)生和疾病預(yù)防控制專業(yè)人員做好該病的發(fā)現(xiàn)、報(bào)告、診斷、治療、個(gè)人防護(hù)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和疫情調(diào)查與處置工作，加強(qiáng)公眾健康教育，制定本技術(shù)指南。
一、目的（一）指導(dǎo)各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)正確開展恙蟲病的診斷和治療，及時(shí)報(bào)告病例。
（二）指導(dǎo)各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)開展恙蟲病監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和疫情控制工作。
二、疾病概述
（一）病原學(xué)
恙蟲病病原體是恙蟲病東方體，原屬于立克次體科(Rickensieae)的立克次體屬(Rickettsia)，后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該病原體的部分生物學(xué)特性明顯不同于該屬其它立克次體，從而將其另立一屬，稱東方體屬(Orientia)，將恙蟲病立克次體改稱為恙蟲病東方體。
1. 生物學(xué)特性
（1）形態(tài)結(jié)構(gòu)
恙蟲病東方體在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核附近的胞質(zhì)內(nèi)寄生，行二分裂繁殖。經(jīng)Giemsa或Guneinez染色光鏡下可見立克次體，大小為0.3-0.5μm×1.2-3.0μm，在電鏡下可見其多形態(tài)，呈圓形、橢圓形、短桿狀及啞鈴狀等。
（2）培養(yǎng)特性
恙蟲病東方體的分離和鑒定常采用小白鼠，培養(yǎng)多采用雞胚卵黃囊和組織細(xì)胞。雞胚培養(yǎng)時(shí)，多采用7-9日齡，行卵黃囊接種，瀕死收獲即可獲豐富的恙蟲病東方體。恙蟲病東方體多采用Vero和L929培養(yǎng)。
2. 恙蟲病東方體的分型
（1）血清型
恙蟲病東方體存在抗原型的多樣性和混合型。迄今為止，世界各地已從患者、媒介昆蟲及嚙齒動(dòng)物中分離到百余株恙蟲病病原體，公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)型為Karp、Kato和Gilliam 3個(gè)血清型，在中國(guó)均有分布，據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)以Karp型為主，長(zhǎng)江以北地區(qū)以Gilliam型居多。
（2）基因型
目前恙蟲病東方體的基因分型多以56kD表面蛋白基因作為目的基因，基因分型主要包括Karp、Kato、Gilliam、TA763、TA678、TA716、Kawasaki、Kuroki、Shimokoshi等，據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)福建、廣東地區(qū)以Karp型為主，江蘇北部、山東地區(qū)以Kawasaki型為主。
（二）流行病學(xué)
1. 宿主動(dòng)物與傳播媒介
鼠類是最重要的儲(chǔ)存宿主，我國(guó)目前已在嚙齒目的18種動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)恙蟲病東方體的自然感染，如黃毛鼠、黑線姬鼠、黃胸鼠等；其次為食蟲目動(dòng)物，如臭鼩鼱、四川短尾鼩。此外，兔、豬、貓和禽類也能感染。
本病的傳播媒介是恙螨（Chigger mite），全球已發(fā)現(xiàn)3000多個(gè)種，我國(guó)有500多個(gè)種，分布遍及全國(guó)。只有少數(shù)恙螨能成為恙蟲病的傳播媒介，我國(guó)已經(jīng)證實(shí)的媒介有地里纖恙螨、小盾纖恙螨、微紅纖恙螨、高湖纖恙螨、海島纖恙螨和吉首纖恙螨等。恙螨一生經(jīng)歷卵、次卵、幼蟲、若蛹、若蟲、成蛹和成蟲7個(gè)時(shí)期，僅幼蟲時(shí)期營(yíng)寄生生活，能夠傳播疾病，其它階段都生存于地面淺表層。恙螨活動(dòng)范圍極小，呈點(diǎn)狀分布，聚集于一處，形成“螨島”。
2. 傳播途徑
本病通過攜帶恙蟲病東方體的恙螨幼蟲叮咬傳播。恙螨幼蟲孵出后，在地面草叢中活動(dòng)，遇到宿主動(dòng)物或人時(shí)即附著其體表叮咬組織液，3-5天吸飽后落于地面。恙螨一生一般只在幼蟲期叮咬宿主動(dòng)物一次，獲得東方體后經(jīng)卵垂直傳播，當(dāng)子代恙螨叮咬人時(shí)傳播本病。
人與人之間不傳染，尚無(wú)接觸危重病人或帶菌動(dòng)物的血液等體液導(dǎo)致傳播的報(bào)道。
3. 人群易感性
人對(duì)恙蟲病東方體普遍易感，病后可獲得較穩(wěn)固的免疫力。流行地區(qū)居民多經(jīng)感染而獲得免疫，通常表現(xiàn)為散發(fā)，外來(lái)人群進(jìn)入疫區(qū)常易發(fā)生流行。
田間勞作的農(nóng)民、野外作業(yè)人員（伐木、筑路工人、地質(zhì)勘探人員等）、野外訓(xùn)練部隊(duì)和野外旅游者等受恙螨侵襲機(jī)會(huì)較多，容易發(fā)生感染。
4. 地理分布和發(fā)病季節(jié)特點(diǎn)
本病主要流行于熱帶和亞熱帶，東亞各國(guó)流行較為廣泛，日本、韓國(guó)、泰國(guó)和澳大利亞等國(guó)家報(bào)道發(fā)病較多。
恙蟲病在我國(guó)呈廣泛分布，除內(nèi)蒙古、青海、寧夏和***外，其余省份都曾有病例報(bào)告。我國(guó)北方和南方的流行季節(jié)有顯著差異。長(zhǎng)江以南地區(qū)以6-8月為流行高峰，屬于“夏季型”，宿主動(dòng)物以黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠和黑線姬鼠為主，主要媒介為地里纖恙螨；長(zhǎng)江以北地區(qū)以10-11月為流行高峰，屬于“秋季型”，宿主動(dòng)物以黑線姬鼠、社鼠和褐家鼠為主，主要媒介為小盾纖恙螨；此外，福建1-2月也曾出現(xiàn)流行高峰，以小盾纖恙螨為主要媒介生物。
（三）主要病理改變及臨床表現(xiàn)
1. 病理改變
此病的基本病理變化是全身小血管炎，導(dǎo)致器官的急性間質(zhì)炎、血管性炎和血管周圍炎。造成實(shí)質(zhì)器官的充血、水腫、細(xì)胞變性，以致壞死。
被恙螨叮咬的局部皮膚先有充血、水腫、形成小丘疹，繼而形成水皰，然后壞死和出血，形成黑色痂皮，稱為焦痂，焦痂附近的淋巴結(jié)腫大。內(nèi)臟普遍充血，肝脾因充血及網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生而腫大，心肌呈局灶性或彌漫性心肌炎，肺有出血性肺炎，腎呈間質(zhì)性炎癥，腦膜可出現(xiàn)淋巴細(xì)胞性腦膜炎。
2. 臨床表現(xiàn)
本病潛伏期4-21天（一般10-14天）。多急性起病，主要臨床特征為發(fā)熱、特異性焦痂或潰瘍、局部或全身淋巴結(jié)腫大、皮疹（充血性、斑疹或斑丘疹）。由于本病造成全身的小血管廣泛受損，可累及多系統(tǒng)多臟器，以呼吸、消化、神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟損害較多見。
發(fā)熱多呈弛張熱或稽留熱，體溫可達(dá)38.5～41℃。發(fā)病初期于叮咬處出現(xiàn)紅色丘疹，繼而成為水泡，以后形成黑褐色焦痂?？沙霈F(xiàn)全身淺表淋巴結(jié)腫大，以焦痂臨近的局部淋巴結(jié)最為明顯。皮疹先于軀干散在性出現(xiàn)，后蔓延至四肢，輕癥患者可無(wú)皮疹，重癥患者皮疹可密集融合，甚至為出血性。
三、診斷、治療和報(bào)告
醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)按照《恙蟲病診療技術(shù)要點(diǎn)（試行）》（附件1）做好診斷和治療。
各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)符合病例定義的恙蟲病疑似、臨床診斷或確診病例時(shí)，可參照乙、丙類傳染病的報(bào)告要求于24小時(shí)內(nèi)通過國(guó)家疾病監(jiān)測(cè)信息報(bào)告管理系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)，報(bào)告疾病類別選擇“其它傳染病”中的“恙蟲病”。疑似病例應(yīng)及時(shí)進(jìn)行訂正。符合《國(guó)家突發(fā)公共衛(wèi)生事件相關(guān)信息報(bào)告管理工作規(guī)范（試行）》要求的，按照相應(yīng)的規(guī)定進(jìn)行報(bào)告。
四、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)專業(yè)人員和臨床醫(yī)務(wù)人員發(fā)現(xiàn)病例時(shí)，應(yīng)認(rèn)真按照《恙蟲病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案（試行）》（附件3）進(jìn)行標(biāo)本的采集、包裝、運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)室無(wú)檢測(cè)條件或無(wú)法鑒定時(shí)，可將原始標(biāo)本及病原分離物送上級(jí)疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行檢測(cè)鑒定。
五、流行病學(xué)調(diào)查
當(dāng)?shù)厥状纬霈F(xiàn)恙蟲病疫情或發(fā)病水平明顯增高時(shí)，縣區(qū)級(jí)疾病預(yù)防控制中心應(yīng)按照《恙蟲病流行病學(xué)調(diào)查方案（試行）》（附件2）立即組織專業(yè)人員開展流行病學(xué)調(diào)查，主要調(diào)查病人的臨床表現(xiàn)、傳染來(lái)源、相關(guān)暴露因素及診療經(jīng)過等，填寫《恙蟲病個(gè)案調(diào)查表》（見附件2）。
出現(xiàn)暴發(fā)疫情時(shí)，應(yīng)開展病例的主動(dòng)搜索，掌握病例數(shù)量及其三間分布，對(duì)宿主動(dòng)物、傳播媒介和暴露因素等進(jìn)行調(diào)查分析，及時(shí)提出有針對(duì)性的預(yù)防控制措施。
六、專題調(diào)查
有條件的地區(qū)，疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)可根據(jù)當(dāng)?shù)匾咔榈奶攸c(diǎn)，參照《恙蟲病專題調(diào)查方案（試行）》（附件4），組織開展人群血清流行病學(xué)、宿主動(dòng)物和傳播媒介等方面的專題調(diào)查。
七、預(yù)防控制措施
（一）加強(qiáng)病例的診斷和規(guī)范性治療
各地應(yīng)開展對(duì)醫(yī)務(wù)人員的培訓(xùn)工作，提高醫(yī)務(wù)人員發(fā)現(xiàn)、識(shí)別恙蟲病的能力，合理治療，減少危重或死亡病例的發(fā)生。
（二）宿主動(dòng)物與媒介的控制
降低環(huán)境中鼠類和恙螨密度是控制本病的重要措施，流行地區(qū)要持續(xù)開展愛國(guó)衛(wèi)生運(yùn)動(dòng)，經(jīng)常清除居住地、作業(yè)場(chǎng)所及道路兩側(cè)的雜草、填平坑洼，以增加日照，降低濕度，使之不適于恙螨的生長(zhǎng)繁殖。對(duì)不能除草的區(qū)域可用化學(xué)殺螨劑噴灑。同時(shí)采取以環(huán)境治理為基礎(chǔ)，藥物毒殺為重要手段的綜合措施控制鼠密度。
（三）做好個(gè)人防護(hù)
做好個(gè)人防護(hù)是預(yù)防本病的有效措施。恙螨主要棲息在草叢或灌木，應(yīng)避免在此類環(huán)境中坐臥休息或晾曬衣被。如需進(jìn)入此類地區(qū)，尤其是已發(fā)現(xiàn)過病人的地區(qū)，應(yīng)注意做好個(gè)人防護(hù)，應(yīng)扎緊袖口、褲管口，襯衣扎入褲腰內(nèi)，減少恙螨的附著或叮咬。
也可在暴露的皮膚和褲腳、領(lǐng)口或袖口上噴涂含鄰苯二甲酸二甲酯或避蚊胺等成分的驅(qū)避劑進(jìn)行防護(hù)，如驅(qū)蚊靈、蚊不叮等。野外作業(yè)后，及時(shí)拍打衣物，抖落附著的恙螨；換衣洗澡，重點(diǎn)擦洗腋窩、腰部、會(huì)陰等皮膚柔軟部位，可減少被恙螨叮咬的機(jī)會(huì)。
（四）做好公眾健康教育
健康教育的要點(diǎn)是指導(dǎo)公眾、特別是高危人群減少或避免恙螨的暴露，以降低感染風(fēng)險(xiǎn)。有恙螨叮咬史或野外活動(dòng)史者，一旦出現(xiàn)疑似癥狀或體征，應(yīng)及早就醫(yī)，并告知醫(yī)生相關(guān)暴露史。
恙蟲病診療技術(shù)要點(diǎn)（試行）
為指導(dǎo)各地及時(shí)、有效、規(guī)范地開展恙蟲病的診斷和救治工作，減少危重病例的發(fā)生，特制定本方案。
1. 臨床表現(xiàn)
潛伏期為4～21天，一般10～14天。急性起病，主要臨床特點(diǎn)為發(fā)熱、特異性焦痂或潰瘍、淋巴結(jié)腫大和皮疹。
1.1 發(fā)熱：體溫多在38.5～41℃， 最高可達(dá)42℃，呈弛張熱或稽留熱，多有畏寒，偶有寒戰(zhàn)。
1.2 焦痂或潰瘍：是恙蟲病特有的體征，發(fā)生率多為50%以上。恙螨幼蟲叮咬處首先出現(xiàn)粉紅色小丘疹，約3～10mm大小，其后逐漸變?yōu)樗?，水泡破裂后中心部位發(fā)生壞死，形成褐色或黑色焦痂。焦痂多為圓形或橢圓形，其邊緣稍隆起，周圍有紅暈，痂皮脫落后中央凹陷形成小潰瘍，無(wú)膿性分泌物；一般無(wú)痛癢感。焦痂或潰瘍可全身分布，但多見于腋窩、腹股溝、外生殖器、肛門等隱蔽、潮濕且氣味較濃的部位。多數(shù)1個(gè)，偶有2～3個(gè)及10個(gè)以上者。因此仔細(xì)查找疑似恙蟲病病人的特異性焦痂或潰瘍是臨床診斷恙蟲病必須的。
1.3 淋巴結(jié)腫大：全身淺表淋巴結(jié)腫大是恙蟲病常見的體征之 一，焦痂或潰瘍臨近的淺表淋巴結(jié)腫大較為明顯。一般在發(fā)熱前就可以觸到。常見的部位是頸部、腋窩、腹股溝。腫大的淋巴結(jié)孤立、游離無(wú)粘連、有壓痛，觸之可動(dòng)，多如黃豆或蠶豆大小、也有鴿蛋大小者，有的甚至于隆起皮膚表面。
1.4 皮疹：皮疹的發(fā)生率有較大差異，可能與病原體的型別不同、病情輕重、就診早晚等因素有關(guān)。多出現(xiàn)在發(fā)病后3～6天，充血性斑丘疹多見，持續(xù)3～7日后逐漸消退。皮疹呈暗紅色，壓之退色。形態(tài)大小不一，一般3～5mm，散在性分布，以胸、背和腹部較多，向四肢發(fā)展，面部很少，手掌腳底無(wú)皮疹。
1.5 其他表現(xiàn)：全身不適、頭昏頭痛、肌肉酸痛、惡心嘔吐、腹痛腹脹、納差乏力等，可有咳嗽咳痰，肝脾腫大、結(jié)膜充血。
1.6 并發(fā)癥：有支氣管肺炎、腦炎或腦膜炎、中耳炎、腮腺炎、血栓性靜脈炎、肝腎功能損害、心肌炎、心功能不全、DIC、感染性休克等，孕婦可發(fā)生流產(chǎn)。死亡病例多發(fā)生于病程的第2～3周。
2. 實(shí)驗(yàn)室檢查
2.1 血常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)多正常，中性粒細(xì)胞分類正?；驕p少，淋巴細(xì)胞分類增多或正常，可有單核細(xì)胞分類增多或血小板減少。
2.2 尿常規(guī)：尿液中常見少量蛋白、白細(xì)胞、紅細(xì)胞或上皮細(xì)胞，
2.3 生化表現(xiàn)：肝功能正?；蜉p度異常，可有心肌酶譜異常，血沉或C反應(yīng)蛋白升高。
2.4 外斐氏試驗(yàn)：?jiǎn)畏菅錙XK效價(jià)≥1:160有診斷意義。病程第一周，一般僅1/3的病例呈陽(yáng)性反應(yīng)，第二周陽(yáng)性率可達(dá)90%，至第四周后陽(yáng)性率又開始下降，2～3個(gè)月后轉(zhuǎn)為陰性。
2.5 間接免疫熒光試驗(yàn) 檢測(cè)病人血清中的特異性IgM、IgG抗體。病程第一周末即可檢出特異性抗體，至第二、三周陽(yáng)性率最高，兩月后逐漸下降，但仍維持一定水平達(dá)數(shù)年之久。如果同時(shí)檢測(cè)雙份血清，IgG抗體滴度4倍及以上升高即可診斷。單份血清IgM抗體滴度≥1:32、IgG抗體滴度≥1:64有診斷意義。
2.6 分子生物學(xué)檢測(cè)：PCR檢測(cè)恙蟲病東方體特異基因片段，具有敏感性高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可用于早期診斷。
2.7 病原體分離：取發(fā)熱期患者血液0.5～1ml，接種小鼠腹腔、雞胚或細(xì)胞，培養(yǎng)分離病原體。
3. 病例診斷
依據(jù)流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室結(jié)果進(jìn)行診斷。在恙蟲病流行區(qū)內(nèi)、流行季節(jié)時(shí)，凡是有不明原因發(fā)熱或淋巴結(jié)腫大者，應(yīng)考慮恙蟲病可能。
3.1 流行病學(xué)史
流行季節(jié)，發(fā)病前3周內(nèi)曾在或到過恙蟲病流行區(qū)，并有野外活動(dòng)史，主要有田間勞作、農(nóng)村垂釣、野營(yíng)訓(xùn)練、草地坐臥、接觸和使用秸桿等。
3.2 臨床表現(xiàn)
3.2.1發(fā)熱
3.2.2淋巴結(jié)腫大
3.2.3皮疹
3.2.4特異性焦痂或潰瘍
3.3 實(shí)驗(yàn)室檢查
3.3.1外斐氏試驗(yàn)陽(yáng)性：?jiǎn)畏菅錙XK效價(jià)≥1:160；
3.3.2間接免疫熒光試驗(yàn)陽(yáng)性：雙份血清IgG抗體滴度4倍及以上升高；
3.3.3 PCR核酸檢測(cè)陽(yáng)性
3.3.4分離到病原體
4. 診斷標(biāo)準(zhǔn)
4.1 疑似病例
具備3.1和3.2.1，加3.2.2、3.2.3任何一條，且明確排除其他疾??；
或無(wú)法獲得明確的流行病學(xué)史，在流行季節(jié)同時(shí)具備3.2.1、3.2.2和 3.2.3三項(xiàng)；
4.2 臨床診斷病例
疑似病例加3.2.4；
或同時(shí)具備3.1、3.2.1、3.2.4三項(xiàng)；
4.3 實(shí)驗(yàn)室診斷病例
疑似病例加3.3.2、3.3.3、3.3.4中的任何一項(xiàng)；
或臨床診斷病例加3.3中的任何一項(xiàng)；
5. 鑒別診斷
本病應(yīng)與傷寒、斑疹傷寒、鉤端螺旋體病、流行性出血熱等疾病相鑒別。
5.1 斑疹傷寒：多見于冬春季節(jié)，無(wú)焦痂和局部淋巴結(jié)腫大，外斐氏試驗(yàn)OX19陽(yáng)性，OXk陰性。流行性斑疹傷寒患者，普氏立克次體為抗原的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽(yáng)性。地方性斑疹傷寒患者，莫氏立克次體為抗原的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽(yáng)性。
5.2 登革熱：急性起病，有高熱、頭痛、皮疹。外周血白細(xì)胞和/或血小板明顯減少，血清中登革病毒抗體陽(yáng)性。
5.3 流行性出血熱：起病急，典型表現(xiàn)有發(fā)熱、出血、腎臟損害。外周血白細(xì)胞增多或正常，血小板減少，蛋白尿。流行性出血熱病毒抗體陽(yáng)性。
5.4 瘧疾：在流行季節(jié)有流行區(qū)居住或旅行史，出現(xiàn)間歇性或規(guī)律性發(fā)作的寒戰(zhàn)、高熱、大汗，伴有貧血和肝脾腫大，惡性瘧熱型不規(guī)則，可引起兇險(xiǎn)發(fā)作。外周血或骨髓涂片瘧原蟲陽(yáng)性。
5.5 鉤端螺旋體?。喊l(fā)病前有疫水接觸史，眼結(jié)膜充血、出血，腓腸肌疼痛明顯，無(wú)焦痂和潰瘍。血清鉤端螺旋體凝集溶解試驗(yàn)陽(yáng)性。
5.6 傳染性單核細(xì)胞增多癥：青少年多見，有發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、咽痛、皮疹，外周血單核細(xì)胞增多，可見異常淋巴細(xì)胞，嗜異凝集試驗(yàn)陽(yáng)性，EB病毒抗體陽(yáng)性。
5.7 傷寒：起病緩慢，表情淡漠，相對(duì)緩脈，胸、腹皮膚可見玫瑰疹，無(wú)焦痂與潰瘍。標(biāo)本中培養(yǎng)出傷寒桿菌，肥達(dá)氏反應(yīng)陽(yáng)性，外斐氏試驗(yàn)陰性。
5.8 皮膚炭疽：有牲畜接觸史，毒血癥狀較輕，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)多增高。潰瘍性黑色焦痂多位于面、頸、手或前臂等暴露部位，取焦痂或潰瘍的分泌物染色鏡檢可發(fā)現(xiàn)炭疽桿菌。
5.9 粟粒性肺結(jié)核：由結(jié)核桿菌發(fā)生血行播散引起，臨床表現(xiàn)復(fù)雜而無(wú)特異性，但通常有結(jié)核病的全身中毒癥狀，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、肝脾腫大、淋巴結(jié)腫大等。
5.10 敗血癥：全身中毒癥狀明顯，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多，中性粒細(xì)胞核左移，血培養(yǎng)陽(yáng)性。
6. 治療
6.1 一般治療
患者應(yīng)臥床休息，加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)，進(jìn)食流質(zhì)或半流質(zhì)食物；注意多飲水，保持水、電解質(zhì)、酸堿和能量平衡；加強(qiáng)護(hù)理和觀察，以便盡早發(fā)現(xiàn)各種并發(fā)癥。
6.2 病原治療
恙蟲病東方體為專性細(xì)胞內(nèi)寄生，應(yīng)選用脂溶性抗生素。β-內(nèi)酰胺類抗生素及氨基糖苷類對(duì)恙蟲病的治療無(wú)效。目前臨床上較常應(yīng)用的抗生素有強(qiáng)力霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和氯霉素，一般以多西環(huán)素為首選。
6.2.1 強(qiáng)力霉素
目前較常應(yīng)用的是強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素類）：成人100mg，每12小時(shí)口服1次，退熱后100mg/d頓服；8歲以上小兒每日2.2mg/kg，每12小時(shí)1次，退熱后按體重2.2mg/kg，每日口服1次。
強(qiáng)力霉素可引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道反應(yīng), 肝功能損害, 脂肪肝變性, 同時(shí)應(yīng)注意過敏反應(yīng)的發(fā)生。孕婦不宜服用強(qiáng)力霉素，8歲以下兒童禁止服用強(qiáng)力霉素。
6.2.2 大環(huán)內(nèi)酯類
常用的是羅紅霉素、克拉霉素和阿奇霉素。
羅紅霉素：成人每次150mg，1日2次，退熱后150mg/d頓服；兒童每次2.5～5mg/kg，1日2次，退熱后劑量減半。
克拉霉素：成人每次500mg，每12小時(shí)1次，6個(gè)月以上的兒童每次7.5mg/kg，每12小時(shí)口服1次。
阿奇霉素：成人每次500mg頓服，退熱后250mg/d頓服，兒童10 mg/kg（1日量最大不超過500mg）頓服，退熱后劑量減半，亦可靜脈滴注阿奇霉素。
大環(huán)內(nèi)酯類的主要不良反應(yīng)為惡心、腹痛、腹瀉、肝功能異常(ALT及AST升高)、頭暈和頭痛等。孕婦及哺乳期婦女需慎用。
6.2.3 氯霉素：成人患者2g/d，分4次口服，退熱后0.5g/d，分2次口服；危重病人亦可靜脈滴注。兒童每日25～50mg/kg，分3～4次服用；新生兒每日不超過25 mg/kg，分4次服用。
氯霉素類可引起外周血白細(xì)胞和血小板減少，有可能誘發(fā)不可逆性再生障礙性貧血、溶血性貧血、過敏反應(yīng)等。在泰國(guó)、緬甸和我國(guó)都曾發(fā)現(xiàn)對(duì)氯霉素耐藥的恙蟲病東方體株。
根據(jù)病人的情況選用上述3類藥物，療程均為7～10日，療程短于7日者，可出現(xiàn)復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)者療程宜適當(dāng)延長(zhǎng)3～4日。
6.3 對(duì)癥治療
高熱者可予物理降溫、解熱鎮(zhèn)痛藥。密切觀察病情變化，出現(xiàn)相關(guān)并發(fā)癥時(shí)加強(qiáng)對(duì)癥、支持處理，病情危重者可進(jìn)行重癥監(jiān)護(hù)治療。應(yīng)慎用激素，但中毒癥狀明顯的重癥患者，在使用有效抗菌素的情況下，可適當(dāng)使用激素。
7. 病人管理
不需要對(duì)病人實(shí)施隔離。
8. 預(yù)后
早期選用有效的抗生素治療，預(yù)后良好，極少發(fā)生死亡。高齡、孕婦、有其他慢性疾病者預(yù)后相對(duì)較差。
恙蟲病流行病學(xué)調(diào)查方案（試行）
為做好恙蟲病疫情的流行病學(xué)調(diào)查，準(zhǔn)確描述疫情分布和分析危險(xiǎn)因素，科學(xué)制訂防控策略和措施，特制定本方案。
一、調(diào)查目的
（一）了解病例臨床特征、暴露史和感染危險(xiǎn)因素。
（二）為核實(shí)診斷和制定有針對(duì)性防控措施提供依據(jù)。
二、調(diào)查內(nèi)容和方法
（一）個(gè)案調(diào)查和標(biāo)本采集
發(fā)現(xiàn)恙蟲病病例后，應(yīng)及時(shí)開展流行病學(xué)個(gè)案調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括病例的基本情況、發(fā)病情況、就診經(jīng)過、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查、診斷、轉(zhuǎn)歸、活動(dòng)史和暴露史、家庭及居住環(huán)境等（見附表《恙蟲病個(gè)案調(diào)查表》），并采集相關(guān)標(biāo)本（見附件3《恙蟲病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案（試行）》）。
1. 基本情況
包括年齡、性別、住址、職業(yè)和文化程度等。
2．臨床資料
通過查閱病歷及化驗(yàn)記錄、詢問經(jīng)治醫(yī)生及病例、病例家屬等方法，詳細(xì)了解病例的發(fā)病經(jīng)過、就診情況、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、診斷、治療、疾病進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸等情況。
3. 病例家庭及居住環(huán)境情況
通過詢問及現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，了解病例情況、家庭居住位置、環(huán)境等。
4. 暴露史及病例發(fā)病前活動(dòng)范圍
詢問病例發(fā)病前3周內(nèi)勞動(dòng)、旅行或可疑暴露史，了解其是否到過有恙螨生長(zhǎng)的場(chǎng)所、防護(hù)情況，是否有恙螨叮咬史。
（二）暴發(fā)調(diào)查
出現(xiàn)暴發(fā)疫情時(shí)，應(yīng)注意調(diào)查感染來(lái)源，組織疾控和醫(yī)療機(jī)構(gòu)專業(yè)人員，采用查看醫(yī)療機(jī)構(gòu)門診日志、住院病歷等臨床資料、入戶調(diào)查等方式，開展病例的主動(dòng)搜索，并對(duì)搜索出的疑似病例進(jìn)行篩查、隨訪，必要時(shí)采集相關(guān)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。
通過查閱資料、咨詢當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)部門等方法，了解當(dāng)?shù)刈匀簧鷳B(tài)環(huán)境、媒介分布，以及相關(guān)的人口、氣象、生產(chǎn)、生活資料等情況，特別是發(fā)病高峰前3周內(nèi)當(dāng)?shù)氐那f稼收種等農(nóng)事活動(dòng)情況等。
三、調(diào)查要求
（一）調(diào)查者及調(diào)查對(duì)象
應(yīng)由經(jīng)過培訓(xùn)的當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機(jī)構(gòu)專業(yè)人員擔(dān)任調(diào)查員?，F(xiàn)場(chǎng)調(diào)查時(shí)，應(yīng)盡可能直接對(duì)病人進(jìn)行訪視、詢問。如病人病情較重或其他原因無(wú)法直接調(diào)查時(shí)，可通過其醫(yī)生、親友、同事或其他知情者進(jìn)行調(diào)查、核實(shí)或補(bǔ)充。
（二）調(diào)查時(shí)間及調(diào)查內(nèi)容。
應(yīng)在接到疫情報(bào)告后迅速開展流行病學(xué)調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容見附表《恙蟲病個(gè)案調(diào)查表》。調(diào)查表應(yīng)填寫完整，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果、病人轉(zhuǎn)歸等情況應(yīng)及時(shí)填補(bǔ)到調(diào)查表中，以完善相關(guān)信息。
（三）調(diào)查者的個(gè)人防護(hù)。
在到農(nóng)田、池塘、草地等高危場(chǎng)所進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，調(diào)查者應(yīng)采取相應(yīng)的個(gè)人防護(hù)措施，避免恙螨叮咬。
四、調(diào)查資料的分析、總結(jié)和利用
（一）在疫情調(diào)查處理進(jìn)程中或結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)對(duì)流行病學(xué)調(diào)查資料進(jìn)行整理、分析，撰寫調(diào)查報(bào)告，并及時(shí)向上級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)及同級(jí)衛(wèi)生行政部門報(bào)告。
（二）省級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)在接到當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)報(bào)告后，應(yīng)及時(shí)將疫情調(diào)查報(bào)告上報(bào)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心。
（三）疫情調(diào)查結(jié)束后，相關(guān)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)將流行病學(xué)調(diào)查的原始資料、分析結(jié)果及調(diào)查報(bào)告及時(shí)整理歸檔。
附表 恙蟲病流行病學(xué)個(gè)案調(diào)查表
地區(qū)國(guó)標(biāo)編碼口口口口口口口口
1．一般情況
1.1姓名： （若為14歲以下兒童，家長(zhǎng)姓名： ）
1.2性別： ①男 ②女
1.3年齡： （歲）
1.4職業(yè)：
①幼托兒童 ②散居兒童 ③學(xué)生 ④教師 ⑤保育員 ⑥餐飲食品人員 ⑦公共場(chǎng)所服務(wù)員 ⑧商務(wù)人員 ⑨醫(yī)務(wù)人員 ○10工人 ○11民工 ○12農(nóng)民 ○13牧民 ○14漁(船)民 ○15海員及長(zhǎng)途駕駛員 ○16公務(wù)人員及職員 ○17離退人員 ○18家政家務(wù)及待業(yè) ○19不詳 ○20其他
1.5文化程度：
①學(xué)齡前兒童 ②文盲 ③小學(xué) ④初中 ⑤高中 ⑥大學(xué)及以上 ⑦不詳
1.6現(xiàn)住址：
1.7工作/學(xué)習(xí)單位：
1.8聯(lián)系電話：
2．發(fā)病情況
2.1發(fā)病日期： 年 月 日
2.2發(fā)病地點(diǎn)：
2.3首診時(shí)間： 年 月 日
2.4首診單位：
2.5首診疾?。?（病名）
2.6是否入院： ①否 ②是（入院時(shí)間： 年 月 日；出院時(shí)間： 年 月 日）
3．臨床資料
3.1臨床表現(xiàn)
3.1.1發(fā)熱：①有 ②無(wú)
3.1.1.1發(fā)熱持續(xù) 天，最高體溫 . ℃
3.1.1.3熱型： ①稽留熱 ②馳張熱 ③不規(guī)則
3.1.2寒戰(zhàn)： ①有 ②無(wú)
3.1.3頭痛： ①有 ②無(wú)
3.1.4結(jié)膜充血： ①有 ②無(wú)
3.1.5皮疹： ①有 ②無(wú)
3.1.6特異性焦痂和潰瘍： ①有（數(shù)目 個(gè)） ②無(wú)
3.1.6.1部位（多選）：①腹股溝 ②肛周 ③會(huì)陰 ④腘窩 ⑤腋窩
⑥胸部（或乳房） ⑦腰帶壓迫部 ⑧背部 ⑨其它
3.1.7 淋巴結(jié)腫大： ①有 ②無(wú)
3.1.7.1主要部位（共用3.1.6.1選項(xiàng)）口口口口
3.1.8 有無(wú)下列表現(xiàn)：
脾大 口 肝大 口 譫妄 口 昏迷 口 嘔吐 口
3.2有無(wú)下列并發(fā)癥？
支氣管肺炎 口 心肌炎 口 心力衰竭 口
其它（注明）：
3.4實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果
3.4.1臨床檢驗(yàn)結(jié)果
（1）血常規(guī)檢測(cè)
檢測(cè)日期 白細(xì)胞計(jì)數(shù)
（×109/升） 中性粒細(xì)胞（%） 淋巴細(xì)胞
（%） 嗜酸性粒細(xì)胞
（%） 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)
（109/升） 血小板計(jì)數(shù)
（109/升） 其它
（2）尿常規(guī)/腎功檢測(cè)
檢測(cè)日期 尿蛋白 白細(xì)胞 紅細(xì)胞 肌酐
（μmol/L） 尿素氮（mmol/L） 其它
（3）肝功能檢測(cè)
丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT： U/L 天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST： U/L
總膽紅素TBLL： μmol/L 直接膽紅素DBLL： μmol/L
（4）血沉： mm/h C反應(yīng)蛋白： mg/L
（5）外斐氏反應(yīng)：檢測(cè)日期 年 月 日，檢測(cè)結(jié)果：①陽(yáng)性 ②陰性
3.4.2 特異性檢測(cè)
檢測(cè)日期 檢測(cè)單位 標(biāo)本類型 檢測(cè)方法* 檢測(cè)結(jié)果 備注
*①間接免疫熒光試驗(yàn) ②PCR ③病原體分離 ④其它（注明具體方法）
4．暴露及危險(xiǎn)因素（發(fā)病前3周內(nèi)）
4.1外出或旅游史： ①有(何地 ) ②無(wú)
4.2有無(wú)下列戶外活動(dòng)：（頻次：①經(jīng)常 ②偶爾 ③無(wú) ④不詳）
戶外活動(dòng)種類 具體地點(diǎn)1 頻次1* 具體地點(diǎn)2 頻次2* 具體地點(diǎn)3 頻次3*
①田間作業(yè)
②放牧
③接觸柴禾
④釣魚
⑤野營(yíng)訓(xùn)練
⑥坐臥草地
⑦野外或公園晨練
⑧草地晾曬衣物
⑨其它1
其它2
其它3
4.3 居住環(huán)境
4.3.1 居住位置 ①村邊 ②村中
4.3.2 住房類型 ①樓房 ②平房 ③草房
4.3.3 院內(nèi)地面 ①水泥地 ②泥地生長(zhǎng)雜草 ③泥地?zé)o雜草
4.3.4 屋內(nèi)是否堆放雜草或農(nóng)作物 ①是 ②否
4.3.5 院內(nèi)是否堆放雜草或農(nóng)作物 ①是 ②否
4.3.6 住宅附近（20米內(nèi)）是否有草地、菜地或溝塘? ①是 ②否
4.4 是否飼養(yǎng)家禽、家畜? ①是 ②否
4.4.1家禽家畜是否養(yǎng)在居住屋內(nèi)? ①是(動(dòng)物種類 ) ②否
4.5 家庭是否有鼠類活動(dòng)? ①經(jīng)常 ②偶爾 ③無(wú) ④不詳
4.6 近期家中有無(wú)類似癥狀病人 ①有 ②無(wú) ③不詳
5．最終診斷
5.1 病人轉(zhuǎn)歸：①痊愈 ②死亡
5.2 診斷疾?。?（病名）
5.3 診斷類型：①實(shí)驗(yàn)室診斷 ②臨床診斷 ③疑似
5.4 診斷醫(yī)院：
5.5 診斷時(shí)間 年 月 日
調(diào) 查 者： 調(diào)查日期： 審核者：
恙蟲病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案（試行）
為保證及時(shí)、科學(xué)地采集、運(yùn)送恙蟲病病例及疫源地調(diào)查的各種類型標(biāo)本，規(guī)范恙蟲病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)程序，提高檢測(cè)質(zhì)量，為明確診斷或開展相關(guān)的科學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，特制定本方案。
一、樣本采集對(duì)象
（一） 恙蟲病病例
（二） 鼠類
（三） 媒介恙螨
二、標(biāo)本種類及采集方法
（一） 病例標(biāo)本
1．全血標(biāo)本
急性期病人需采集全血，常用EDTA或枸櫞酸鹽（適用于PCR檢測(cè)）或肝素（適用于細(xì)胞分離培養(yǎng)）抗凝真空采血管采集血液3～5ml，用于病原分離及PCR檢測(cè)。應(yīng)盡可能在病人使用抗生素前進(jìn)行血液標(biāo)本的采集。
2．血清標(biāo)本
用無(wú)菌真空采血管，采集病人非抗凝血3～5ml，用于血清抗體檢測(cè)。采集后，應(yīng)及時(shí)分離血清；血清標(biāo)本可暫時(shí)于4℃保存，若超過48小時(shí)，需-20℃保存。急性期血清盡可能在發(fā)病后1周內(nèi)采集，發(fā)病2～4周內(nèi)，采集恢復(fù)期血清（血凝塊于-20℃保存?zhèn)溆茫?/span>
3．病人焦痂
將病人焦痂取下后放入1.5ml無(wú)菌離心管中，-20℃保存，用于PCR檢測(cè)。
（二）鼠類標(biāo)本采集
用注射器無(wú)菌操作采集鼠心臟血、股動(dòng)脈或腋下靜脈血，用于IgG抗體檢測(cè)。采用無(wú)菌方法解剖鼠，取其脾、肝、腎標(biāo)本，置入相應(yīng)編號(hào)的無(wú)菌凍存管內(nèi)，應(yīng)盡快送回實(shí)驗(yàn)室分離病原體。否則應(yīng)置于液氮罐內(nèi)或－80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。
（三）恙螨標(biāo)本的采集
將捕獲的鼠處死后，齊耳根剪下鼠耳，放入編號(hào)的凍存管內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃冰箱放置3~5天，讓恙螨自行爬下，切忌硬挑使標(biāo)本受到破壞。待恙螨幼蟲爬下后，在解剖鏡下將鼠耳上的恙螨全部挑入盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，每只鼠耳的恙螨放一培養(yǎng)皿，計(jì)數(shù)，將不同外部形態(tài)的恙螨按抽取一定比例，用改良的幼蟲封藏液（阿拉伯樹膠25 g，蒸餾水35 ml，水合氯醛35 g，甘油12 ml，50%葡萄糖漿3 ml）封片，鑒定種類，統(tǒng)計(jì)恙螨種類組成；其余恙螨經(jīng)初步鑒定分類后，以50-100只同種恙螨為1組，分別用含青霉素和鏈霉素的生理鹽水洗滌數(shù)次后，研磨制成懸液，立即接種小鼠分離恙蟲病東方體。如進(jìn)行PCR檢測(cè)，恙螨于-80℃或-20℃冰箱中保存。
三、標(biāo)本采集和保存注意事項(xiàng)
標(biāo)本采集應(yīng)符合無(wú)菌操作要求。用于病原培養(yǎng)分離的各種標(biāo)本應(yīng)立即接種小白鼠?？鼓绮荒芰⒓创策吔臃N，應(yīng)置于4℃環(huán)境保存（不超過3天），避免冰凍。非抗凝血應(yīng)及時(shí)分離血清。
標(biāo)本采集后，應(yīng)認(rèn)真填寫采樣登記表（見附件4中附表）。
四、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
（一）血清學(xué)檢測(cè)
恙蟲病的血清學(xué)檢測(cè)方法較多，目前應(yīng)用較廣的主要有外斐氏反應(yīng)和間接免疫熒光試驗(yàn)。
1. 外斐氏反應(yīng)
是用變形桿菌OXK抗原檢測(cè)血清抗恙蟲病東方體抗體，方法簡(jiǎn)單、快速，方便基層使用，但特異性較差。OXK≥1:160有診斷意義。一般于病程第一周僅1/3的病例呈陽(yáng)性反應(yīng)，至第二周陽(yáng)性率可達(dá)90%，至第四周后陽(yáng)性率又開始下降，2～3個(gè)月后轉(zhuǎn)為陰性。
2. 間接免疫熒光試驗(yàn)
特異性和靈敏度均較高，是國(guó)際上通用的血清學(xué)檢測(cè)方法，有條件的實(shí)驗(yàn)室可采用該方法進(jìn)行血清學(xué)診斷。病程第一周末即可檢出特異性抗體，至第二、三周陽(yáng)性率最高，兩月后逐漸下降，但仍維持一定水平達(dá)數(shù)年之久。如同時(shí)檢測(cè)雙份血清，IgG抗體滴度4倍及以上升高，可診斷為恙蟲病東方體感染。單份血清IgM抗體滴度≥1:32、IgG抗體滴度≥1:64有診斷意義。
（二）PCR檢測(cè)
PCR技術(shù)可成功地應(yīng)用于檢測(cè)臨床標(biāo)本中的恙蟲病東方體DNA，靈敏度和特異性好，擴(kuò)增產(chǎn)物可測(cè)序驗(yàn)證，是一種簡(jiǎn)便、可靠的早期診斷方法。實(shí)際應(yīng)用中，焦痂標(biāo)本PCR擴(kuò)增陽(yáng)性率較高。
1. DNA提取
使用市售的商品化試劑盒提取DNA。
2. 巢式PCR檢測(cè)
恙蟲病東方體56kDa蛋白基因的開放讀碼框架為1600nt左右，是PCR檢測(cè)最常用的擴(kuò)增靶基因，巢式PCR檢測(cè)可提高檢測(cè)靈敏度和特異度。PCR檢測(cè)應(yīng)分區(qū)進(jìn)行，避免污染。使用引物序列見表1。
表1 巢式PCR檢測(cè)恙蟲病東方體引物
引物 序 列 擴(kuò)增片段
a 5'- TACATTAGCTGCGGGTATGACA-3' 306～339bp
b 5'- CCAGCATAATTCTTCAACCAAG-3'
a′ 5'- GAGCAGAGCTAGGTGTTATGTA-3' 150～168bp
b′ 5'- TAGGCATTATAGTAGGCTGAGG-3'
PCR反應(yīng)混合物的準(zhǔn)備按常規(guī)進(jìn)行。第一輪反應(yīng)采用外引物對(duì)a和b，DNA模板5μl。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl，其它成分的濃度按常規(guī)進(jìn)行。反應(yīng)程序如下：
表2 巢式PCR檢測(cè)恙蟲病東方體反應(yīng)參數(shù)
循環(huán)數(shù) 變性94℃ 退火溫度第一、二輪均選50 ℃ 延伸72℃
1 5 min
35 1 min 1 min 1 min
1 5 min
第二輪反應(yīng)使用引物對(duì)a′、b′進(jìn)行巢式PCR。檢測(cè)樣本取第一輪產(chǎn)物1～2μl為模板，陽(yáng)性對(duì)照取1μl為模板。反應(yīng)程序同第一輪反應(yīng)。
電泳：擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。
結(jié)果判定：凝膠成像系統(tǒng)讀取結(jié)果，若在150-168bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，則所檢樣品為陽(yáng)性，即初步判斷有恙蟲病東方體DNA檢出，進(jìn)一步確定應(yīng)將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證。
（三）病原體分離培養(yǎng)。
恙蟲病東方體是專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，其分離培養(yǎng)有直接動(dòng)物分離、雞胚培養(yǎng)和組織細(xì)胞培養(yǎng)。
1．動(dòng)物分離
常用小白鼠作為接種的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。采集的標(biāo)本可直接進(jìn)行小鼠腹腔接種，臨床病人采用床邊接種小鼠的方法分離率最高。采集全血分離病原體的操作步驟如下：
（1）使用肝素抗凝真空采血管從患者靜脈采血3-5毫升，取0.5毫升立即接種小鼠腹腔，每份血液注射2～3只，若不能立即接種，置于4℃保存。
（2）注射畢，置于籠內(nèi)飼養(yǎng)，每日觀察其發(fā)病情況。被接種鼠多在14～19天內(nèi)死亡。鼠死前呈現(xiàn)顯著病態(tài)，如皮毛松豎，不活潑，閉目，腹部膨大，有波動(dòng)，呼吸短促、急迫等現(xiàn)象。解剖肉眼觀察，腹腔內(nèi)常積有大量滲出液，脾腫大，淋巴結(jié)腫大和皮下充血常見。采用環(huán)磷酰胺處理過的小鼠可提高恙蟲病東方體弱毒株的分離效果。具體方法為，接種標(biāo)本約48小時(shí)前給每只小鼠注射環(huán)磷酰胺2mg，接種標(biāo)本約72小時(shí)后再給小鼠注射環(huán)磷酰胺2mg。
（3）病原體檢查 用腹水涂片或脾臟印片，姬姆薩染色，在油鏡下觀察，若在單核細(xì)胞的細(xì)胞核周圍發(fā)現(xiàn)有一些成簇存在的顆粒，其形態(tài)多為球狀或短桿狀，顏色與細(xì)胞核染色相同，呈紅色至紫紅色，即可判斷為病原體檢查陽(yáng)性（圖1）。
圖1 恙蟲病東方體感染小鼠腹膜Giemsa染色形態(tài)（1000×）
2．組織細(xì)胞分離
恙蟲病東方體可感染多種細(xì)胞，常用的細(xì)胞有Vero、Hela、L929等，可取臨床標(biāo)本直接接種細(xì)胞，或發(fā)病小鼠取腹水、肝、脾或腎研磨制成懸液接種細(xì)胞。細(xì)胞分離恙蟲病東方體應(yīng)注意嚴(yán)格無(wú)菌操作。以L929細(xì)胞為例，分離恙蟲病東方體的操作步驟如下：
（1）按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，將長(zhǎng)成單層的L929細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液吸凈，用RPMI 1640洗兩次后，再把RPMI 1640吸凈。
（2）新鮮抗凝的血液標(biāo)本取0.5ml，加入上述洗滌過的L929單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入生長(zhǎng)液5ml，置34℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)孵育12小時(shí)，換維持液（2%血清）后繼續(xù)培養(yǎng)。
（3）對(duì)-80℃低溫冰箱或液氮中凍存的標(biāo)本，取出，待血液自管壁分離后倒入無(wú)菌離心管內(nèi)，逐次加入冷肝素PBS（20U/ml），使其完全解凍，1500rpm離心5min，棄去上清液。
（4）于盛標(biāo)本的離心管中加入0.1ml蔗糖磷酸鹽緩沖液，將沉淀物充分混勻后吸出，入上述洗滌過的L929單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置34℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1小時(shí)，取出加入生長(zhǎng)液5ml，再放回34℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育過夜，次日取出，吸出生長(zhǎng)液，換入維持液（2%血清）繼續(xù)孵育，每3天換維持液一次，共孵育7～10天。
3．雞胚培養(yǎng) 恙蟲病東方體可接種至7～9日齡雞胚的卵黃囊中，并能在其中生長(zhǎng)，在雞胚瀕死時(shí)收獲卵黃囊膜，可獲得繁殖豐富的菌體。
病原體的鑒定：細(xì)胞培養(yǎng)物觀察細(xì)胞病變，感染細(xì)胞涂片姬姆薩染色檢查，各種培養(yǎng)物可通過特異引物進(jìn)行PCR鑒定。
五、生物安全
在標(biāo)本采集、運(yùn)輸及實(shí)驗(yàn)室工作過程中，生物安全應(yīng)參照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》中的有關(guān)要求進(jìn)行。
（一）實(shí)驗(yàn)室生物安全
標(biāo)本滅活、病原DNA標(biāo)本提取及病原體分離操作應(yīng)在生物安全Ⅱ級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。非感染性材料的檢測(cè)可在生物安全I(xiàn)級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
（二）血液標(biāo)本采集安全注意事項(xiàng)
采集病例的標(biāo)本時(shí)，應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)。
（三）采集動(dòng)物宿主與媒介恙螨標(biāo)本個(gè)人防護(hù)
野外采集標(biāo)本時(shí)，應(yīng)穿著顏色明亮的防護(hù)服，并將衣袖或褲管口扎緊以防蜱螨等昆蟲叮咬。野外作業(yè)或活動(dòng)的人員可使用驅(qū)避劑或防蚊油噴涂皮膚。
（四）標(biāo)本運(yùn)輸安全注意事項(xiàng)
應(yīng)參照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》中的有關(guān)要求（B類）進(jìn)行。
（五）在診療及標(biāo)本的采集、包裝和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等過程中所產(chǎn)生的醫(yī)療廢物，應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》等相關(guān)規(guī)定處理。
恙蟲病專題調(diào)查方案（試行）
為指導(dǎo)發(fā)生疫情的地區(qū)開展恙蟲病的疫源地調(diào)查，了解我國(guó)恙蟲病自然疫源地的分布情況，同時(shí)增進(jìn)對(duì)該病病原學(xué)、傳播機(jī)制及危險(xiǎn)因素等的認(rèn)識(shí)，為制訂相應(yīng)的防控策略和措施提供科學(xué)依據(jù)，特制訂本方案。
一、調(diào)查目的
（一）了解恙蟲病疫區(qū)人群感染狀況及抗體水平。
（二）了解當(dāng)?shù)厥箢惖姆N類、密度及帶菌狀況。
（三）了解當(dāng)?shù)?a target="_blank">恙蟲病傳播的主要恙螨種類、數(shù)量、分布及帶菌狀況。
二、調(diào)查內(nèi)容與方法
（一）人群血清流行病學(xué)調(diào)查
1. 調(diào)查方法
各地根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r，采集疫區(qū)部分人群血清。每次采集非抗凝靜脈血5ml，分離血清，檢測(cè)IgG抗體并對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本做倍比稀釋，檢測(cè)滴度。血清標(biāo)本的包裝、貯存、運(yùn)送及檢測(cè)見《恙蟲病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案（試行）》（附件3）。
2. 資料的分析與利用
根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算調(diào)查人群的血清抗體陽(yáng)性率和抗體水平（幾何平均滴度），分析人群既往感染的情況。
（二）宿主動(dòng)物調(diào)查
1. 調(diào)查地點(diǎn)和時(shí)間
在病例可能感染的地點(diǎn)，或根據(jù)當(dāng)?shù)氐牡乩砭坝^和生境，選擇宿主動(dòng)物調(diào)查的地點(diǎn)。調(diào)查時(shí)間可選擇在疫情發(fā)生后或宿主動(dòng)物活動(dòng)高峰季節(jié)。
2. 鼠類捕獲及密度調(diào)查
推薦采用籠夜法進(jìn)行。
（1）居民區(qū)：每個(gè)居民區(qū)按方位選擇20戶以上居民，于傍晚每戶放置5個(gè)（鼠籠盡量放置家中不同房間），連續(xù)放置3天，每日清晨取回捕獲鼠的鼠籠，放入白色布袋內(nèi)，系緊袋口，做好記錄，并編號(hào)。誘餌用花生米或油條、油餅等（同一地區(qū)應(yīng)選用同一種誘餌）。
（2）野外：在野外不同生境放置300籠次以上，于傍晚時(shí)布放鼠籠，行距應(yīng)在30m以上，籠間距為5m，并做好標(biāo)記。誘餌應(yīng)統(tǒng)一。次日清晨取回鼠籠，將捕獲鼠的鼠籠放入白色布袋內(nèi)，系緊袋口，做好標(biāo)記，并編號(hào)。
3. 動(dòng)物的分類、鑒定
參考《中國(guó)重要醫(yī)學(xué)動(dòng)物鑒定手冊(cè)》等相關(guān)專業(yè)資料，鑒定宿主動(dòng)物的種類、學(xué)名等。
4. 標(biāo)本采集及處理
（1）體表寄生物檢查
將鼠置于密閉容器內(nèi)，用乙醚麻醉。將鼠置于白瓷盤中，梳子梳理鼠類體毛，用稍濕的毛筆將掉在瓷盤中的寄生物，如蚤、蜱、螨等，同一只鼠的寄生物按類別分別置入盛有75％乙醇的凍存管中，并標(biāo)記相應(yīng)鼠只的編號(hào)，以待鑒定，如果需要對(duì)寄生物進(jìn)行病原學(xué)分離，應(yīng)直接將寄生物研碎后接種小白鼠。
（2）采血
用注射器無(wú)菌操作采集鼠心臟血、股動(dòng)脈或腋下靜脈非抗凝血，用于IgG抗體檢測(cè)。
（3）采集內(nèi)臟標(biāo)本
采用無(wú)菌方法解剖鼠，取其脾、肝、腎標(biāo)本，置入相應(yīng)編號(hào)的無(wú)菌凍存管內(nèi)，送回實(shí)驗(yàn)室后立即分離病原體。否則應(yīng)置于液氮罐內(nèi)或－80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。
5. 核酸檢測(cè)及病原分離
（1）采用PCR檢測(cè)鼠類標(biāo)本中的恙蟲病東方體DNA，測(cè)定核苷酸序列。
（2）有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行病原體分離與鑒定。陽(yáng)性病原分離物可送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心作進(jìn)一步鑒定。
方法見附件3《恙蟲病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案（試行）》。
6. 計(jì)算不同生境的鼠種構(gòu)成及鼠密度，鼠類的帶菌率。
（三）媒介恙螨的調(diào)查
1. 調(diào)查地點(diǎn)和時(shí)間
在病例可能感染的地點(diǎn)，或根據(jù)當(dāng)?shù)氐牡乩砭坝^選擇媒介恙螨的調(diào)查地點(diǎn)。調(diào)查時(shí)間可選擇在疫情發(fā)生后，或恙螨活動(dòng)高峰季節(jié)。
2. 采集方法
（1）檢查宿主動(dòng)物
主要捕捉野鼠進(jìn)行調(diào)查，具體捕鼠方法參見前。將捕獲的鼠處死后，齊耳根剪下鼠耳，放入編號(hào)的凍存管內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃冰箱放置3~5天，讓恙螨自行爬下，切忌硬挑使標(biāo)本受到破壞。待恙螨幼蟲爬下后，在解剖鏡下將鼠耳上的恙螨全部挑入盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，每只鼠耳的恙螨放一培養(yǎng)皿，計(jì)數(shù)，將不同外部形態(tài)的恙螨按抽取一定比例，用改良的幼蟲封藏液封片、鑒定；其余恙螨經(jīng)初步鑒定分類后，以50-100只同種恙螨為1組，分別用含青霉素和鏈霉素的生理鹽水洗滌數(shù)次后，研磨制成懸液，立即接種小鼠分離恙蟲病東方體。如進(jìn)行PCR檢測(cè)，恙螨于-80℃或-20℃冰箱中保存。根據(jù)調(diào)查結(jié)果計(jì)算出鼠的帶恙螨率和帶恙螨指數(shù)。
帶恙螨率（%）=帶恙螨鼠數(shù)/捕鼠總數(shù)×100%
帶恙螨指數(shù)=鼠體恙螨總數(shù)/捕鼠總數(shù)
（2）小黑板法
流行季時(shí)，選擇晴天9-11時(shí)或14-16時(shí)，將小黑板（15cm×15cm×0.5cm）平放在草地等可能有恙螨的地點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)2塊，10min檢查一次。檢查時(shí)用手握住板的兩個(gè)對(duì)角，按自下而上，自左至右的順序觀察板的正面和側(cè)面。在板面上發(fā)現(xiàn)的恙螨幼蟲似粉筆灰大小，呈淡紅色，近似圓形，有3對(duì)足，爬行緩慢，肉眼可見。然后用稍濕的細(xì)毛筆將幼蟲挑入含75%乙醇的凍存管內(nèi)保存待查。采集標(biāo)本人員應(yīng)注意個(gè)人防護(hù)。根據(jù)調(diào)查結(jié)果計(jì)算出小黑板的帶恙螨率和帶恙螨指數(shù)。
帶恙螨率（%）=帶恙螨小黑板數(shù)/放小黑板總數(shù)×100%
帶恙螨指數(shù)=采集恙螨總數(shù)/放小黑板總數(shù)
3. 恙螨的分類、鑒定
參考有關(guān)專業(yè)資料，對(duì)采集的恙螨進(jìn)行分類和鑒定。若當(dāng)?shù)責(zé)o法鑒定，可將采集到的恙螨若干只置于75%乙醇溶液中保存，送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所鑒定。
4. 恙蟲病東方體核酸檢測(cè)及病原分離
（1）采用PCR擴(kuò)增恙螨標(biāo)本的恙蟲病東方體DNA，并測(cè)定核苷酸序列。
（2）有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)恙螨標(biāo)本進(jìn)行病原分離和鑒定。陽(yáng)性病原分離物可送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心作進(jìn)一步鑒定。
方法見附件3《恙蟲病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案（試行）》。
5. 計(jì)算恙螨種的構(gòu)成、總帶菌率及各種恙螨的帶菌率。
三、資料的收集、管理和利用
（一）一般背景資料的收集
收集當(dāng)?shù)氐囊话惚尘百Y料，如調(diào)查時(shí)當(dāng)?shù)氐臍庀筚Y料（氣溫、降雨量、濕度等）、地理狀況（地理位置、地形、地貌、湖泊、河流、流域等）、人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料、生產(chǎn)及生活方式（農(nóng)、牧業(yè)、狩獵等活動(dòng)）、生活及衛(wèi)生習(xí)慣、特殊風(fēng)俗、社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況以及其他相關(guān)資料等。
（二）資料的收集、管理和利用
收集專題調(diào)查的相關(guān)資料，包括各種采樣登記表、檢測(cè)登記表、檢測(cè)報(bào)告等（附表1-8）。
現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)撰寫專題調(diào)查報(bào)告，上報(bào)上級(jí)疾控機(jī)構(gòu)及同級(jí)衛(wèi)生行政部門，并將專題調(diào)查的原始記錄、匯總整理資料、分析數(shù)據(jù)及調(diào)查報(bào)告等及時(shí)整理、歸檔。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)將檢測(cè)結(jié)果反饋給當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機(jī)構(gòu)，由當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機(jī)構(gòu)告知相關(guān)單位及被調(diào)查者。
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